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本制品是采用探针法进行Real-Time PCR的专用试剂，适合于FAM/HEX/TET/JOE/ROX等双标记探针（本品也适用于Molecular Beacon探针）。其中5×Probe RT-PCR MasterMix是将热启动Fast Taq DNA聚合酶、MLV反转录酶、RNase Inhibitor、反应Buffer、dNTP等试剂预混的一种5×浓度的单组分预混试剂。进行实验时，PCR反应液的配制十分方便简单，只需加入引物、探针、模板、水即可。该制品不含有ROX校正染料，适用于各种荧光标记探针，并且适用于各种定量PCR机型。

本制品中的Fast Taq DNA聚合酶采用专有的热启动技术确保55℃以下没有任何活性，因此可在室温建立反应体系。Fast Taq DNA聚合酶具有卓越的扩增速度，因此满足快速PCR程序，通常在30min以内可以完成扩增反应。同时该聚合酶具有耐受杂质的能力，同样适用于粗制核酸样本的扩增反应。

• 热启动酶采用专有的修饰方式，30s热启动。
  
• 一步法RNA TaqMan qPCR单组份预混试剂。
  
• 卓越的扩增性能，耐受样本中的杂质能力强。
  
• 高灵敏度，可检测低丰度基因。
  
• 适用于所有实时定量PCR仪器。

• 进行RNA的One-Step qPCR检测
  进行RNA的qPCR检测时，检测模板为RNA，在反转录酶的作用下，由下游引物进行反转录反应，反转录反应完毕后获得cDNA，再启动PCR的扩增，并对cDNA进行扩增，整个过程在一种试剂中一步完成（One-Step qPCR）。按照如下组分配制20μL PCR反应体系：
  

  成分	用量	终浓度
  5×Probe RT-PCR MasterMix	4μL	1×
  PCR Forward Primer(10μM)	0.4μL	0.2μM
  PCR Reverse Primer(10μM)	0.4μL	0.2μM
  Probe (10μM)	0.2μL	0.1μM
  RNA模板	0.5～2μL
  ddH2O	至20μL

  
  注意：
  ① 通常使用0.4μL的扩增引物可获得理想的扩增结果，必要时可在0.2～0.8μL之间进行调整。
  ② 探针的浓度在50～250 nM之间调整；在双探针检测时通常探针用量减半，扩增引物浓度保持不变。
  ③ qPCR灵敏度极高，建立反应体系时加入模板量的准确程度对最终定量结果会有很大的影响。建议将模板稀释后加入反应体系中，这样可以有效提高实验的重复性。
  
• RNA的One-Step qPCR反应程序如下：
  

  步骤	温度	时间	说明	循环数
  Stage 1	55℃	10min	反转录获得cDNA	1
  Stage 2	95℃	30s		1
  Stage 3	95℃	5s		40
  	60℃	20s	收集荧光信号

  
  注意：
  ① 预变性30s适合绝大多数扩增反应，如模板结构复杂，可将预变性时间延长至3min。
  ② 对于200bp以内的片段，延伸时间最短可设为10sec；超过200bp时，推荐延伸时间为20～30sec。
  
• 反应结束后确认Real-Time PCR的扩增曲线。

• 探针位置尽可能地靠近上游引物。
  
• 探针长度应在15～45bp（最好是20～30bp)，以保证结合特异性。
  
• 探针Tm值在65～70℃，通常比引物TM值高5～10℃（至少要5℃），GC含量在40%～70%。
  
• 探针的5’端应避免使用G，因为5'G会有淬灭作用。
  
• 整条探针中，C的含量要明显高于G的含量；避免出现重复的碱基。
  
• 为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。
  
• 尽量避免出现重复的碱基，尤其是G碱基，应避免出现4个或4个以上的G重复出现。

• 扩增曲线异常
  
  • 扩增曲线不平滑：模板浓度太低或模板纯度低，换用高质量模板。
    
  • 扩增曲线断裂或下滑：模板浓度较高引起，基线的终点值大于CT值。减小基线终点(CT值-4)，重新分析数据。
    
  • 个别扩增曲线突然下降：反应管内留有气泡，配好反应体系上机前要进行离心，避免管里气泡的出现。
• 反应结束无扩增曲线
  
  • 确认程序设置是否正确：是否设置了收集信号步骤，两步法扩增程序一般设置在退火延伸阶段，三步法设置在72℃延伸阶段。
    
  • 模板降解或浓度偏低：如模板降解需重新制备新的模板，浓度偏低可通过减少稀释度重复实验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。
    
  • 确认引物是否降解：长时间未用的引物应先通过PAGE电泳检测完整性，以排除其降解的可能。
• CT值偏大
  
  • 扩增效率低：优化反应条件包括引物序列和引物浓度，或尝试三步法扩增程序。
    
  • 模板降解或浓度偏低：如模板降解需重新制备新的模板，浓度偏低可通过减少稀释度重复实验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。
    
  • PCR产物太长：推荐PCR产物长度为100～200bp。
    d体系中存在PCR抑制剂：一般为模板带入，将模板加大倍数稀释后再进行扩增，或重新制备模板。
• 阴性对照出现明显扩增
  
  • 反应体系污染：用气溶胶去除剂（货号：MT3001）处理实验台面和环境，更换新的Mix、水、引物再进行实验。
    
  • 引物二聚体的出现：配合融解曲线进行分析。
• 绝对定量时标准曲线线性关系不佳
  
  • 模板浓度太高：提高模板稀释倍数，采用专用稀释液。
    
  • 某个标准品降解：重新制备标准品再进行实验。
    
  • 加样误差：提高模板稀释倍数后再进行实验。
• 实验重复性差
  
  • 加样体积导致：提高模板稀释倍数，用准确的移液器。
    
  • 定期校准qPCR仪器和移液器。
    
  • 模板浓度太低：模板浓度越低，重复性越差，减少模板稀释度或提高加样体积。